ИРН AP27510713 Тема проекта «Оценка распространенности антибиотикорезистентных условно-патогенных бактерий в экосистемах поверхностных и подземных вод»

Период реализации 2025-2027 гг.

Актуальность

Устойчивость бактерий к антибиотикам в последние годы вызывает растущую обеспокоенность в различных сферах человеческой жизнедеятельности во всем мире. Неправильное и чрезмерное использование антимикробных препаратов способствовало развитию у бактерий специфической резистентности формирующаяся в результате наличия в геноме бактерий особых генов ответственных за устойчивость к антибиотикам. Отдельные представители домена бактерии проявляют множественную устойчивость к антибиотикам, что осложняет процесс и меры борьбы с данными представителями патогенных микроорганизмов. При этом микроорганизмы, а в частности бактерии повсеместно распространены в природе что, несомненно, повышает уровень потенциального риска и угрозы здоровью человека и животных. К тому же основной благоприятной средой для жизнедеятельности и размножения бактерий неотъемлемо является вода и водная среда. Скорость распространения микроорганизмов в воде намного выше, чем в любом другом природном субстрате, а также постоянный круговорот воды способствует быстрому и широкому распространению бактериального сообщества в природных условиях. В связи с вышесказанным для выделения антибиотикоустойчивых условно-патогенных бактерий при реализации представленного исследовательского проекта будут использоваться пробы воды с естественных источников. Идея проекта заключается в оценке распространённости мультирезистенных условно-патогенных бактерий в естественных экосистемах поверхностных и подземных вод Западно-Казахстанкой области (ЗКО). Основа проекта заключается в проведении комплексных исследований по идентификации бактерий, определения их биохимических характеристик, оценки реакции на воздействие антимикробных препаратов, с учетом выявление ответственных генов, анализу факторов вирулентности, а также выявлению риска негативного влияния бактерий с множественной устойчивостью к антибиотикам на окружающую среду. Полученные результаты ареала распространения, видовой принадлежности, биохимических характеристик, анализа устойчивости к противомикробным препаратам, а также вирулентность изолированных штаммов бактерий позволять оценить уровень влияния антропогенного воздействия на микробиоту естественных водных источников, с целью разработок рекомендаций по урегулированию использовании противомикробных препаратов. В результате исследований будет создана карта распространения условно-патогенных, антибиотикоустойчивых штаммов бактерий естественных водных источников ЗКО, с полным биологическим описанием видов включая биохимическую и молекулярно-генетическую идентификацию, ареал распространения, устойчивость к антибиотикам и факторы вирулентности.

Цель

Исследовать распространенность и разнообразие устойчивых к антибиотикам условно-патогенных бактерий в экосистемах поверхностных и подземных вод, а также определить потенциальный риск воздействия изолированных штаммов бактерий на окружающую среду путем оценки их устойчивости к антибиотикам, биохимических характеристик и факторов вирулентности.

Задачи проекта

Задача 1. Создание коллекции культур условно-патогенных бактерий входящие в класс Gammaproteobacteria выделенных из отобранных проб воды экосистемы поверхностных и подземных вод Западно-Казахстанской области. Эта задача имеет три основные цели: (i) Отбор проб воды из экосистем поверхностных и подземных вод ЗКО, с последующим созданием карты отобранных образцов. (ii) Выделение «чистых» культур бактерий на жидких и твердых питательных средах. (iii) Определение морфологии и культуральных свойств изолированных колоний бактерий. Выполнение задачи 1 позволит создать собственную коллекцию культур условно-патогенных бактерий для последующих исследований.

Задача 2. Идентификация выделенных колоний условно-патогенных бактерий входящие в класс Gammaproteobacteria. Эта задача имеет две основные цели: (i) Определение родовой принадлежности выделенных колоний бактерий в результате оценки биохимических характеристик. (ii) Молекулярно-генетическая идентификация изолятов бактерий на основании ПЦР метода с использованием родоспецифических пар праймеров, а также секвенирование гена 16S рРНК. При выполнении задачи 2 будет идентифицирована родовая и видовая принадлежность изолированных штаммов бактерий.

Задача 3. Оценка распространенности антибиотикоустойчивых бактерий входящие в класс Gammaproteobacteria в естественных водных источниках, находящихся в пределах территории Западно-Казахстанской области. Эта задача имеет две основные цели: (i) Определение устойчивости изолированных штаммов бактерий к β-лактамным антибиотикам, а также антибиотикам группы тетрациклины, аминогликозиды и амфениколы. (ii) Анализ наличия в геноме штаммов бактерий генов ответственных за устойчивость к антибиотикам. Решение задачи 3 позволит определить широту распространения бактерий, проявляющих множественную устойчивость к антибиотикам в естественной среде.

Задача 4. Определение факторов вирулентности у изолированных штаммов бактерий. Выполнение задачи 4 позволить выявить основные гены патогенности у изолированных антибиотикоустойчивых штаммов поверхностных и подземных вод, а также определить потенциальный риск для человека и животных.

Ожидаемые результаты

В результате исследований будут: - создана коллекции культур условно-патогенных бактерий входящие в класс Gammaproteobacteria выделенных из отобранных проб воды экосистемы поверхностных и подземных вод Западно-Казахстанской области; - будет проведен отбор проб воды из экосистем поверхностных и подземных вод ЗКО. Создана карта отобранных образцов. Будут отобраны 60 проб из не менее 10 водоемов ЗКО (1 проба с поверхности, 1 проба с глубины из 3 точек одного водоема) и 30 проб из колодцев 10 населенных пунктов ЗКО с указанием географического расположения точек отбора; - будут выделены «чистые» культуры бактерий на жидких и твердых питательных средах входящие в класс Gammaproteobacteria. Определены оптимальные условия выращивания; - будут определены морфологические свойства изолированных колоний бактерий. Будут определены такие свойства как: форма, размер, поверхность, профиль, прозрачность, цвет, структура и консистенция; - будут идентифицированы выделенные колонии условно-патогенных бактерий входящие в класс Gammaproteobacteria; - будет определена родовая принадлежность выделенных колоний бактерий в результате оценки их биохимических характеристик; - будет проведена молекулярно-генетическая идентификация изолятов бактерий на основании ПЦР метода с использованием родоспецифических пар праймеров, а также секвенирование гена 16S рРНК; - будет дана оценка распространенности антибиотикоустойчивых бактерий входящие в класс Gammaproteobacteria в естественных водных источниках, находящихся в пределах территории Западно-Казахстанской области; - будут определена устойчивость изолированных штаммов бактерий к β-лактамным антибиотикам, а также антибиотикам группы тетрациклины, аминогликозиды и амфениколы; - будет проведен анализ наличия в ДНК штаммов бактерий генов (acrD, aadA, aadB, blaKPC, qnrA, sul1, tet(A) и mecA) ответственных за устойчивость к антибиотикам; - будут определены факторы вирулентности у изолированных штаммов бактерий. Будет проведено полногеномное секвенирование. Будут опубликованы:

- не менее 2 (двух) статей и (или) обзоров в рецензируемых научных изданиях по научному направлению проекта, индексируемых в Science Citation Index Expanded и входящих в 1 (первый), 2 (второй) либо 3 (третий) квартиль по импакт-фактору в базе Web of Science и (или) имеющих процентиль по CiteScore в базе Scopus не менее 50 (пятидесяти);

- не менее 2 (двух) статей или обзора в рецензируемом зарубежном или отечественном издании, рекомендованном из списков 1 и 2 КОКНВО;

- либо не менее 1 (одной) статьи или обзора в рецензируемом научном издании, индексируемом в Science Citation Index Expanded и входящем в 1 (первый) квартиль по импакт-фактору в базе Web of Science и (или) имеющих процентиль по CiteScore в базе Scopus не менее 80 (восмидесяти).

- не менее 1 (одной) статьи или обзора в рецензируемом зарубежном или отечественном издании, рекомендованном из списков 1 и 2 КОКНВО.

Достигнутые результаты

Проведен отбор проб воды из экосистем поверхностных и подземных вод ЗКО. Создана карта отобранных образцов. Отобраны 216 проб воды из 12 водоемов ЗКО (1 пробы с поверхности, 1 пробы с глубины из 9 точек одного водоема) и 30 проб из колодцев 10 населенных пунктов ЗКО с указанием географического расположения точек отбора. В результате анализа были исследованы следующие озера ЗКО из степной зоны: Брусяное (51°21.426' с.ш., 051°50.913' в.д.), Прорва (51°14.573' с.ш., 051°31.220' в.д.), Жалтырколь (50°59.388' с.ш., 051°25.864' в.д.), Жаманкара (50°56.147' с.ш., 051°51.704' в.д.); из полупустынной зоны: Коловертное (50°36.013' с.ш., 051°06.764' в.д.), Глубинное (50°19.630' с.ш., 051°03.445' в.д.), Рыбный Сакрыл (49°37.871' с.ш., 049°21.447' в.д.), Сарышыганак (49°27.901' с.ш., 049°51.589' в.д.); из пустынной зоны: Едильсор (49°13.361' с.ш., 050°44.029' в.д.), Айдын (48°57.133' с.ш., 049°35.183' в.д.), Карасу (48°49.407' с.ш., 051°52.274' в.д.), Тасонгар (49°21.311' с.ш., 050°22.046' в.д.)), а также следующие населенные пункты: Озерное (51°21.724' с.ш., 051°50.272' в.д.), Желаево (51°15.122' с.ш., 051°30.007' в.д.), Кемер (51°01.585' с.ш., 051°24.870' в.д.), Бекей (50°57.435' с.ш., 051°46.805' в.д.), Коловертное (50°35.613' с.ш., 051°06.645' в.д.), Жанабулак (50°18.953' с.ш., 051°03.915' в.д.), Жалпактал (49°35.003' с.ш., 49°21.265' в.д.), Кособа (49°27.177' с.ш., 050°17.572' в.д.), Кызылбас (49°25.874' с.ш., 050°15.380' в.д.), Жангала (49°13.202' с.ш., 050°17.460' в.д.). Изученные водоёмы существенно различаются по своим физико-химическим характеристикам, что связано с их географическим положением, глубиной, типом донных отложений и степенью минерализации. Большинство водоёмов имеют щелочную среду (pH от 8,0 до 9,6), что является типичным для степных и солоноватоводных озёр. Уровень растворённого кислорода варьируется в широком диапазоне – от крайне низких значений (2,5–4,1 мг/л в озере Сарышыганак) до очень высоких (более 20 мг/л в озере Тасонгар). Это может свидетельствовать как о бедности воды кислородом вследствие органического загрязнения, так и об активном фотосинтезе в условиях высокой температуры и солнечной активности. Температура воды в разных водоёмах также заметно отличается: наименьшие значения наблюдаются в озёрах Брусяное и Жаманкара (около 20-21 °C), а наивысшие в озёрах Прорва, Глубинное, Тасонгар и Коловертное (до 27 °C), что может быть связано с их географическим положением и мелководностью. Минерализация вод показывает значительные колебания: от очень слабоминерализованных (1,6-3,7 мг/л в озёрах Сарышыганак, Карасу и Айдын) до высокоминерализованных водоёмов, таких как Тасонгар (до 10 мг/л) и Жалтырколь (до 528,7 мг/л). Электропроводность вод также варьирует от очень низкой (около 3–7,5 мкСм/см в солоноватых озёрах: Рыбный Сакрыл, Сарышыганак, Едильсор, Карасу и Айдын) до средних (от 28,1 до 174,1 мкСм/см в озерах Тасонгар и Жаманкара) и высоких значений (до 948,7 мкСм/см в озёрах с высоким содержанием солей и органики, таких как Жалтырколь, Брусяное, Прорва, Коловертное и Глубинное). Прозрачность вод в большинстве водоёмов низкая, что указывает на высокую степень мутности или наличие взвешенных веществ. Водоёмы с чёрным или серым илом на дне, как правило, характеризуются меньшей прозрачностью и более высокими показателями органического загрязнения. Песчаное дно (к примеру, в озере Прорва или Жаманкара) связано с более высокими показателями прозрачности и лучшей аэрацией. В целом, можно отметить, что среди всех водоёмов наилучшее кислородное насыщение наблюдается в Тасонгаре, Едильсоре и Коловертном, а наихудшее – в Сарышыганаке и Рыбном Сакрыле, что может свидетельствовать о неблагополучном экологическом состоянии последних. Вода из колодцев в разных населённых пунктах демонстрирует значительное разнообразие по физико-химическим показателям. Температура воды в колодцах колеблется в пределах 14,3–17,2 °C, что характерно для подземных вод и зависит от глубины и сезонных условий. Концентрация растворённого кислорода сильно варьирует – от низких значений около 1,4 мг/л в Кызылбасе до высоких, превышающих 10 мг/л в Желаево и Жанабулаке, что отражает различия в аэрации и проникновении кислорода в подземные горизонты. Процент насыщения кислородом находится в широком диапазоне (от 13,4 % до 110 %), что может указывать как на застойные или загрязнённые участки, так и на более свежие, аэрированные воды. Минерализация колодезной воды отличается по населённым пунктам: в одних колодцах она достаточно высокая (около 460 мг/л в Озёрном, Желаево и Жалпактале), что говорит о значительном содержании растворённых солей, в других - гораздо ниже (1,4–4 мг/л в Кемере, Коловертном). Солёность варьируется от очень низкой (0,25 ‰, Кызылбас) до умеренной (4,6 ‰, Жангала), что также указывает на разницу в составе подземных вод. Значения pH преимущественно нейтральные или слабо щелочные (7,2–8,35), что обычно характерно для грунтовых вод и благоприятно для питьевого использования. Электропроводность воды колеблется от низкой (около 2,6 мкСм/см, Коловертное) до очень высокой (свыше 1600 мкСм/см, Кособа), что отражает различия в ионном составе и минерализации. Глубина колодцев варьируется от мелких (3–5 м: Кособа, Кызылбас, Жангала) и средних (7,5-9,7 м: Бекей, Жалпактал, Озерное) до более глубоких (свыше 20 м: Желаево, Кемер, Коловертное, Жанабулак), что влияет на качество воды и её физико-химические характеристики. В целом, данные свидетельствуют о неоднородности качества подземных вод в разных населённых пунктах, что требует учёта при их использовании для питьевых и хозяйственных нужд.

Выделены «чистые» культуры бактерий на жидких и твердых питательных средах входящие в класс Gammaproteobacteria. Определены оптимальные условия выращивания. В результате исследований выделено 1080 и 150 «чистых» культур бактерий из проб воды из озер и колодцев соответственно. Исследования проводились на питательных средах Луриа-Бертани (ЛБ) с- и без добавления агара. При выращивании на среде LB применяли так же постоянное перемешивание среды и аэрацию. Установлено, что наилучший рост культур наблюдается при температуре 30–37 °C и нейтральном уровне pH (7,0–7,2). Поддержание аэрации обеспечивало активное размножение клеток и стабильную метаболическую активность что, способствовало увеличению биомассы и ускорению фазы экспоненциального роста.

Определены морфологические свойства изолированных колоний бактерий. Определены такие свойства как: форма, размер, поверхность, профиль, прозрачность, цвет, структура и консистенция. В результате исследований колоний бактерий определено что из 1080 колоний бактерий выделенных из воды озер характеризовались следующими свойствами, такими как, форма: круглая – 1040 (96,3%), амебовидная – 40 (3,7%); размер: 0,5 мм – 39 (3,61%), 1 мм – 198 (18,33%), 1,5 мм – 319 (29,54%), 2 мм – 154 (14,26%), 2,5 мм – 175 (16,2%), 3 мм – 72 (6,67%), 3,5 мм – 45 (4,17%), 4 мм – 22 (2,04%), 4,5 мм – 28 (2,59%), 5 мм – 13 (1,2%), 5,5 мм – 5 (0,46%), 6 мм – 3 (0,28%), 7 мм – 1 (0,09%), 7,5 мм – 1 (0,09%), 8 мм – 1 (0,09%), 10 мм – 2 (0,19%), 12 мм – 2 (0,19%); поверхность: гладкая – 967 (89,5%), шероховатая – 113 (10,5%); профиль: выпуклый – 1075 (99,5%); плоский – 5 (0,5%); прозрачность: непрозрачная – 1041 (96,4%), полупрозрачная – 25 (2,3%), прозрачная – 14 (1,3%); цвет: белый – 46 (4,25%), бежевый – 583 (54%), светло-серый – 353 (32,69%), светло-коричневый – 1 (0,09%), бежево-серый – 1 (0,09%), желтая – 90 (8,33%), розовый – 5 (0,46%), светло-розовые – 1 (0,09%); края: волнистые – 171 (15,8%), ровные – 908 (84,1%), зубчатые – 1 (0,1%); структура: однородная – 1080 (100%); консистенция: мягкая – 1076 (99,6%), твердая – 4 (0,4%). В результате исследований колоний бактерий определено что из 150 колоний бактерий выделенных из воды колодцев характеризовались следующими свойствами, такими как, форма: круглая – 143 (95,3%); амёбовидная – 7 (4,7%); размер: 0,5 мм – 12 (8%), 1 мм – 36 (24%), 1,5 мм – 29 (19,33%), 2 мм – 24 (16%), 2,5 мм – 30 (20%), 3 мм – 6 (4%), 3,5 мм – 3 (2%), 4 мм – 1 (0,67%), 4,5 мм – 2 (1,33%), 5 мм – 4 (2,67%), 5,5 мм – 1 (0,67%), 6 мм – 1 (0,67%), 6,5 мм – 1 (0,67%), поверхность: гладкая – 137 (91,3%), шероховатая – 13 (8,7%); профиль: выпуклый – 149 (99,3%), плоский – 1 (0,7%); прозрачность: непрозрачная – 144 (96%), полупрозрачная – 6 (4%), цвет: бежевый – 77 (51,3%), светло-серый – 40 (26,7%), жёлтая – 24 (16%), белый – 8 (5,3%), серый – 1 (0,7%); края: ровные – 139 (92,7%), волнистые – 11 (7,3%); структура: однородная – 150 (100%); консистенция: мягкая – 146 (97,3%), твёрдая – 4 (2,7%).

Бакиев Серик Самигуллович – руководитель проекта, PhD.

Scopus Author ID,

(https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=57214922444).

Researcher ID, (AAM-9369-2020)

ORCID https://orcid.org/0000-0001-5095-6869

Email.: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript.

Какишев Мурат Галиханович – старший научный сотрудник, PhD,

Scopus Author ID,

(https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=55693811900).

Researcher ID, (AR-6321-2020)

ORCID (http://orcid.org/0000-0002-4601-4921)

Алыбаев Санжар Досанович – старший научный сотрудник, магистр биологических наук.

Scopus Author ID,

(https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=57203727066).

Researcher ID, (N-2501-2015)

ORCID (http://orcid.org/0000-0002-7909-1835)

Сарманов Айбек Ертлеуович – научный сотрудник, магистр сельскохозяйственных наук.

Scopus Author ID,

(https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=58065685300).

Researcher ID, (HKE-0868-2023)

ORCID (https://orcid.org/0000-0002-3647-2347)

Султанов Ержан Сахыпжанович – научный сотрудник, магистр сельскохозяйственных наук.

Scopus Author ID,

(https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=59482962100).

Researcher ID, (LZP-2103-2025)

ORCID (https://orcid.org/0009-0004-6218-8739)

Қабдрахимов Әліби Асқарұлы - научный сотрудник, магистр биологических наук.

Scopus Author ID,

(https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=58942027400).

ORCID (https://orcid.org/0000-0002-3721-1691)